Chemotherapie wordt al tientallen jaren gebruikt in de strijd tegen kanker. Enkele zeer veel gebruikte chemotherapeutica zijn drugs die ingrijpen op het cytoskelet van de cel, de microtubules (oa vinblastine en paclitaxel). Deze drugs binden direct aan de microtubules en beïnvloeden de dynamische eigenschappen van deze structuren. Microtubules zijn essentiele structuren die er voor zorgen dat het genetisch materiaal, de chromosomen, tijdens de celdeling (mitose) correct wordt verdeeld over de twee dochter-cellen. Milde verstoring van deze verdeling, leidt tot aneuploidy wat hoogstwaarschijnlijk een belangrijke drijfveer is voor tumorgenese. Echter, een sterke verstoring van de microtubules, en daarmee de chromosoom verdeling, leidt onherroepelijk tot celdood. Door de microtubules te verstoren die nodig zijn voor goede chromosoom verdeling, zorgen dergelijke microtubule verstorende drugs er dus voor dat  sneldelende cellen, zoals tumor cellen, dood gaan. Nadeel van een dergelijke behandeling is echter dat ook gezonde delende cellen worden gedood door dit soort middelen. Daarnaast zijn ook veel niet delende cellen afhankelijk van microtubules, wat leidt tot ernstige bijeffecten en beperkte toepas mogelijkheden van deze middelen.

Het doel van deze studie was om andere eiwitten te identificeren die net als microtubules essentieel zijn voor mitose, maar die in tegenstelling tot microtubules, niet essentieel zijn voor niet delende cellen. Deze eiwitten zouden dan potentiele targets zijn voor een anti-tumor drugs. Omdat bepaalde typen eiwitten (kinases) makkelijker met drugs te remmen zijn dan anderen, heb ik ervoor gekozen om deze selectieve groep eiwitten te testen voor een mogelijke rol in de celdeling. De familie van kinases bestaat uit ongeveer 740 eiwitten, dus het was essentieel om een systematische aanpak op te zetten. Om de eiwitten allemaal individueel te kunnen remmen, heb ik gebruikt gemaakt van de RNAi technologie, waarmee individuele mRNA’s, die voor de verschillende eiwitten coderen, vernietigd kunnen worden. Het probleem met RNAi is echter dat vele RNAi’s niet werken en het van te voren niet te voorspellen is of een specifieke RNAi gaat werken of niet. Daarom heb ik per gen 3 RNAi’s ontworpen, zodat er zeker 1 zou werken. Echter, dit betekent dat er 2220 RNAi’s getest moesten worden.

Om dit project geheel objectief en geautomatiseerd te laten verlopen, heb ik ervoor gekozen om gebruik te maken van een geautomatiseerde microscoop opstelling. Hiervoor ben ik naar het Biomedicum instituut in Helsinki, Finland gegaan, alwaar een dergelijke microscoop opstelling aanwezig is. Met de microscoop opstelling is het mogelijk om geautomatiseerde opnames te maken van alle welletjes in een 96-wells plaat en software te ontwikkelen die de opnames volledig automatisch analyseert. Ik heb hiervoor verschillende kleuringen getest, waarmee ik de delende cellen aan kon kleuren om deze te analyseren na behandeling met een specifieke RNAi. Hierna heb ik de software door ontwikkeld om deze kleuringen te herkennen en het aantal cellen te scoren met een defecte deling. Op deze wijze kon ik, na optimalisatie, volledige geautomatiseerd 2220 RNAi’s testen in minder dan drie weken. Uit deze eerste screen kwamen ongeveer 30 kinases die nodig bleken te zijn voor mitose, waarvan tot op heden geen rol in mitose bekend was.

Uit de lijst van 30 kinases heb ik mij toen gefocused op een zeer interessant gen, wat bekend stond om diens rol in de internalisering (endocytose) van onder andere groeifactor receptors. Na nauwkeurige analyse van dit gen met behulp van time-lapse microscopy en confocale microscopy op gefixeerde samples, kan ik nu concluderen dat dit gen nodig is voor de correcte migratie van chromosomen tijdens mitose. Om de essentiele functie van dit gen in mitose verder te valideren, heb ik gekeken naar enkele andere tumorcel lijnen en daaruit bleek dat onafhankelijk van de oorsprong van de tumor, dit eiwit essentieel is voor de deling van tumor cellen. Op basis van dit onderzoek, hebben we dus vast kunnen stellen dat dit eiwit een mogelijke nieuwe target is voor een anti-kanker therapie.

Om meer te leren over het mechanisme achter deze nieuwe functie heb ik vervolgens gekeken of de rol van dit eiwit in endocytose essentieel is voor zijn rol in chromosoom segregatie. Om dit te testen, heb ik naar enkele andere, gerelateerde eiwitten gekeken of zij een dergelijke essentiele rol in mitose hebben. Voor het meerendeel van de eiwitten bleek dit niet het geval te zijn, waaruit blijkt dat deze functie zeer specifiek.

De volgende vraag was of deze nieuwe functie in mitose gerelateerd was aan diens functie in endocytose. Door gebruik te maken van de RNAi-rescue strategie, waarbij het endogene gen wordt verwijderd en wordt vervangen door een exogene versie, heb ik sterk bewijs gevonden dat de functie binnen endocytose inderdaad direct gekoppeld is aan de functie in mitose. Uit de laatste proeven die ik heb uitgevoerd op basis van de financiele ondersteuning van de Dr. Saal van Zwanenburg stichting, is gebleken dat dit nieuwe eiwit een regulator is van het zeer belangrijke endocytose eiwit Clathrin. Clathrin is essentieel voor endocytose en voor mitose en uit mijn experimenten blijkt dat het door ons gevonden eiwit hoogstwaarschijnlijk nodig is om Clathrin in een actieve staat te houden voor zijn taken in mitose

In samenvatting heb ik het project zoals beschreven in het voorstel in zijn geheel kunnen uitvoeren en hiermee een mogelijk nieuw anti-kanker target ontdekt en tegelijkertijd een belangrijk nieuw mechanisme ontdekt dat de cel deling reguleert.
Deze vindingen zullen hoogstwaarschijnlijk worden gepubliceerd, zodra het mechanisme van deze nieuwe functie geheel is ontrafeld.